LINIE | Vanilleschoten-Gruppe

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 1537 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Expression des Long Interspersed Element 1 (LINE-1) Open Reading Frame 1 Protein (ORF1p) ist ein gemeinsames Merkmal vieler Krebsarten, einschließlich des hochgradigen serösen Ovarialkarzinoms (HGSOC). Hier berichten wir, dass ORF1p nicht nur exprimiert, sondern auch von Eierstockkrebs und primären Tumorzellen freigesetzt wird. Untersuchungen zur Überwachung mehrerer Immunreaktionen und Massenspektrometrietests zeigten, dass freigesetztes ORF1p sicher in konditionierten Medien, Aszites und Patientenplasma nachweisbar ist, was darauf schließen lässt, dass ORF1p ein potenzieller Biomarker ist. Interessanterweise ist die ORF1p-Expression in epithelialen Vorläufern von HGSOC im Eileiter (FT) nachweisbar, nicht jedoch in gutartiger FT, was darauf hindeutet, dass die ORF1p-Expression ein frühes Ereignis in der HGSOC-Entwicklung ist. Schließlich führte die Behandlung von FT-Zellen mit DNA-Methyltransferase-Inhibitoren zu einer robusten Expression und Freisetzung von ORF1p, was die regulatorische Rolle der DNA-Methylierung bei der LINE-1-Repression in nicht tumorigenem Gewebe bestätigte.

Eierstockkrebs ist nach wie vor eine der Hauptursachen für krebsbedingte Sterblichkeit in entwickelten Ländern und verursacht jährlich etwa 180.000 Todesfälle weltweit1. Allein in den Vereinigten Staaten gab es nach Schätzungen der American Cancer Society im Jahr 2022 19.880 neue Fälle und über 12.810 Todesfälle aufgrund von Eierstockkrebs2,3. Eierstockkrebs ist eine heterogene Erkrankung und der häufigste Subtyp ist das hochgradige seröse Ovarialkarzinom (HGSOC)4. Die meisten Patienten mit HGSOC kommen mit einer fortgeschrittenen Erkrankung in die Behandlung. Zu diesem Zeitpunkt sind längere Remissionen nach der Primärtherapie selten und Rezidive sind durch eine zunehmende Chemoresistenz gekennzeichnet. Daher besteht ein dringender Bedarf an verbesserten Strategien zur Früherkennung von Eierstockkrebs, um die Mortalität zu senken5,6. Leider muss noch ein ausreichend empfindlicher und spezifischer Screening-Test entwickelt werden, der das Überleben verbessert. Das derzeit beste verfügbare Instrument zur Beurteilung von Eierstockerkrankungen ist der transvaginale Ultraschall (TVS). Mehrere groß angelegte Studien konnten jedoch keine ausreichende Sensitivität und Spezifität für TVS nachweisen, um seinen Einsatz als Screening-Instrument zu rechtfertigen7,8. Während CA-125 und HE4 gut charakterisierte Biomarker bei Eierstockkrebs sind9,10,11,12,13, beschränkt sich ihre klinische Anwendung derzeit auf die Analyse der therapeutischen Wirksamkeit und die Erkennung von Krankheitsrückfällen14. Jüngste Ergebnisse der UKCTOCS-Studie (United Kingdom Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening) legen nahe, dass ein multimodales Screening mit Serum-CA-125, interpretiert mithilfe des Risk of Ovarian Cancer Algorithm (ROCA), transvaginalem Ultraschall und klinischer Beurteilung, zu einer Verschiebung nach früher führen kann -Stadiumserkennung und -behandlung15. Leider zeigte die Langzeitbeobachtung der UKCTOCS-Studie, dass die beim multimodalen Screening beobachtete Verringerung der Inzidenz im Stadium III oder IV nicht zu geretteten Leben führte16. Es ist wichtig zu beachten, dass etwa 20 % der Eierstockkrebserkrankungen kein CA-125 produzieren und bei einem Ansatz, der ausschließlich auf diesem Biomarker basiert, übersehen würden17. Zusammengenommen unterstreichen diese Ergebnisse die Notwendigkeit der Identifizierung breit anwendbarer Biomarker, die auf einem umfassenderen Verständnis der Krankheitsbiologie beruhen.

Mit der Entwicklung proteomischer Technologien ist es möglich, eine systematische Charakterisierung von Proteinen vorzunehmen, die von in der Tumormikroumgebung ansässigen Zelltypen in den Zwischenraum freigesetzt werden. Interstitielle Gewebeflüssigkeit (TIF) besteht aus der Flüssigkeit zwischen Blutgefäßen und umgebenden Gewebezellen, macht 16 % des Gewichts des menschlichen Körpers aus und stellt eine neuartige und vielversprechende Quelle für Biomarker dar18. Wir haben kürzlich eine proteomweite Analyse von TIF aus normalem Eileiterepithel (FT) abgeschlossen und HGSOC abgeglichen (Gillette et al., Manuskript in Vorbereitung). Zu den Proteinen, die im TIF von HGSOC am unterschiedlichsten nachgewiesen werden, gehört das lang eingestreute Element-1 (LINE-1) retrotransponierbare Element-ORF1-Protein (ORF1p).

Transponierbare Elemente (TEs) können in zwei Hauptklassen unterteilt werden: DNA-Transposons und Retrotransposons. Retrotransposons sind bei weitem die am häufigsten vorkommenden TEs im menschlichen Genom und vermehren sich selbst über RNA-Zwischenprodukte, die revers transkribiert und an neuen Stellen im Genom eingefügt werden19. Retrotransposons können weiter in zwei Gruppen unterteilt werden, die sich durch das Vorhandensein oder Fehlen von langen terminalen Wiederholungen (LTRs) unterscheiden. Die überwiegende Mehrheit der menschlichen TEs spiegelt die gegenwärtige und vergangene Aktivität von Nicht-LTR-Retrotransposons wider, charakterisiert durch LINE-120,21. LINE-1-Elemente sind die am häufigsten vorkommenden und einzigen aktiven proteinkodierenden Retrotransposons und machen etwa 17 % des menschlichen Genoms aus. Im menschlichen Genom sind ungefähr 500.000 verkürzte Kopien und 6.000 LINE-1-Kopien in voller Länge vorhanden22. Die Transkription wird durch einen CpG-Dinukleotid-reichen internen RNA-Polymerase-II-Promotor21,22 gesteuert, die Expression in erwachsenen menschlichen Zellen wird jedoch normalerweise durch DNA-Methylierung20 unterdrückt. Interessanterweise ist der Verlust der LINE-1-DNA-Methylierung ein häufiger Phänotyp, der bei Eierstockkrebs und anderen Krebsarten auftritt19.

LINE-1 enthält zwei offene Leserahmen (ORFs): ORF1 kodiert ein RNA-bindendes Protein (ORF1p) und ORF2 kodiert ein Protein mit Reverse-Transkriptase- und Endonuklease-Aktivitäten (ORF2p)21,23. Eine abweichende Expression von ORF1p wurde in einer Reihe von Studien bei Epithelkrebs, einschließlich Eierstockkrebs, dokumentiert24,25,26,27,28,29,30,31 und macht ORF1p zu einem vielversprechenden Krebsbiomarker. Trotz der hohen Konzentrationen von ORF1p in Krebszellen wurde die ORF2p-Expression mit Standardmethoden zum Proteinnachweis nie nachgewiesen32.

In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass ORF1p nicht nur exprimiert, sondern auch von HGSOC und primären Tumorzelllinien freigesetzt wird. Wir haben Assays zur Immunaffinitätsanreicherung auf Peptidebene (Immuno-MRM, iMRM33,34,35,36,37,38,39,40) in Kombination mit gezielter Massenspektrometrie entwickelt, um sekretiertes ORF1p in konditionierten Medien, Aszites und Patientenplasma nachzuweisen Proben. Wir zeigen auch, dass die Expression von ORF1p ein frühes Ereignis in der Entwicklung von HGSOC ist, da die ORF1p-Färbung in STIC-Läsionsproben deutlich zu finden ist. Darüber hinaus wurde ORF1p in zufälligen STIC-Läsionen bei risikomindernden Operationen und ohne invasive Erkrankung gefunden, was bestätigt, dass der Übergang vom normalen FT-Epithel zu HGSOC-Vorläuferläsionen durch den Erwerb der ORF1p-Expression gekennzeichnet ist, die im fortgeschrittenen HGSOC erhalten bleibt. Interessanterweise fanden wir heraus, dass DNA-Demethylierungsmittel die Expression und Freisetzung von ORF1p durch FT-Zellen auslösen, wodurch die DNA-Methylierung experimentell als notwendiger Mechanismus zur Einschränkung der ORF1p-Expression in gutartigen FT-Zellen validiert wurde.

Die Fälle für diese Studie wurden von den Abteilungen für Pathologie des Brigham and Women's Hospital und des Hospitals der University of Pennsylvania erhalten. Aus 30 Fällen, deren ursprüngliche Pathologieberichte auf das Vorhandensein von HGSOC hinwiesen, wurden in Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) Blöcke aus Eileitergewebe geschnitten. Unter diesen Fällen wurde in 18 Fällen eine STIC diagnostiziert und in 25 Fällen wurde ein gutartiges FT-Epithel diagnostiziert. Wir haben außerdem 12 Fälle von gutartiger FT von Patienten erhalten, deren Eileiter aus Gründen entfernt wurden, die nichts mit Krebs oder Krebsrisiko zu tun haben, und sechs Fälle von zufälligen STIC-Läsionen (nur In-situ-Karzinom), die bei einer risikomindernden Operation für BRCA1/2-Mutationen identifiziert wurden. Diese Hämatoxylin- und Eosin-Objektträger (H&E) wurden von drei Pathologen (MSH, LS, RD) überprüft, um das Vorhandensein von STICs und möglicherweise invasiven Karzinomen in den tieferen Gewebeabschnitten zu bestätigen. Die in dieser Studie verwendeten Plasmaproben wurden aus dem Depot von Dr. Steven Skates am Massachusetts General Hospital bezogen. Es wurden 72 Plasmaproben von Patienten mit papillärem serösem Ovarialkarzinom im fortgeschrittenen Stadium (III und IV) (Ergänzungstabelle 1) und 37 Kontrollplasmaproben analysiert.

Die immunhistochemische Färbung wurde mit dem Envision Plus/Meerrettich-Peroxidase-System (DAKO) durchgeführt. FFPE-Gewebeschnitte wurden entparaffiniert, rehydriert und 30 Minuten lang in Wasserstoffperoxidlösung inkubiert, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Die Antigengewinnung wurde bei einer 20-minütigen Behandlung bei 100 °C in Citratpuffer (pH 6,0) durchgeführt. Die Schnitte wurden mit Primärantikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert. Der Sekundärantikörper wurde 30 Minuten lang aufgetragen, gefolgt von 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) für 5 Minuten. Alle H&E- und IHC-Bilder wurden mit dem Aperio CS2-Objektträgerscanner von Leica BioSystems (Buffalo Grove, IL) aufgenommen.

Wir verwendeten einen monoklonalen Anti-LORF1-Antikörper (Klon 4H1; Millipore), um die ORF1p-Expression zu untersuchen. Die ORF1p-Färbung wurde von zwei gynäkologischen Pathologen (LES und MSH) anhand der folgenden vierstufigen Skala bewertet: 0 (alle Zellen negativ), 1 + (vereinzelte seltene Zellen ≤ 10 % positive Zellen), 2 + (fokale oder multifokale Färbung = 10). –75 % positive Zellen) oder 3 + (diffuse Färbung ≥ 75 % positive Zellen). Alle Flecken und Scores wurden von einem dritten Pathologen (RD) überprüft und in zwei Gruppen dichotomisiert: Scores von 0 und 1+ wurden als „ORF1p-negativ“ definiert, während Scores von 2+ und 3+ als „ORF1p-positiv“ kategorisiert wurden.

Die Zellen wurden über Nacht auf Glasdeckgläsern gezüchtet. Die Zellen wurden mit 4 % Paraformaldehyd/PBS 20 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert. Die Zellen wurden mit 3 % BSA in 1X PBS blockiert und mit primärem Antikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert. Der sekundäre Antikörper wurde 0,5 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der Nachweis wurde unter Verwendung sekundärer Antikörper durchgeführt, die an Alexa 488 Fluor Dyes (Molecular Probes; Thermo Fisher Scientific) konjugiert waren. Deckgläser wurden mit DAPI-haltigem Medium auf Objektträger montiert. Die Zellen wurden mikroskopisch mit einem Nikon E400-Mikroskop analysiert.

In dieser Studie wurden acht Ovarialkarzinomzelllinien (KURAMOCHI, OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-8, OVKATE, COV318, OVSAHO und CaOV3) verwendet. Alle Eierstockkrebs-Zelllinien mit Ausnahme von COV318 und CaOV3 wurden in RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS; Atlanta Biologicals), kultiviert. COV318 und CaOV3 wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Thermo Fisher Scientific) mit 10 % fötalem Rinderserum kultiviert. Alle Zelllinien wurden im Jahr 2022 mittels Short Tandem Repeat (STR)-Profiling (IDEXX, Columbus, MO) authentifiziert und mit dem Cambrex MycoAlert-Assay (University of Pennsylvania Perelman School of Medicine Cell Center) auf Mykoplasmenfreiheit getestet. Die Etablierung der Eileiterzelllinien (FT189, FT194, FT237, FT240 und FT246) wurde bereits beschrieben41,42. FT-Zellen wurden in DMEM/Ham's F-12 1:1 (Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 2 % Ultroser G-Serumersatz (Pall Life Sciences), kultiviert. Primäre HGSOC-Zellen (DF-Zelllinien) wurden wie zuvor beschrieben isoliert43. DF-Zellen wurden in Renaissance Essential Tumor Medium (RETM; Cellaria Biosciences), ergänzt mit 5 % hitzeinaktiviertem FBS, kultiviert. Alle Zellen wurden bei 37 ° C und einer 5 % CO2-haltigen Atmosphäre gezüchtet (siehe Ergänzungstabelle 2).

Kultivierte FT-Zelllinien wurden 3, 5 oder 7 Tage lang mit Decitabin (TOCRIS, Kat.-Nr. 2624) oder SGI-110 (Guadecitabin) (Adooq Bioscience, Kat.-Nr. A12744) in einer Konzentration von 5 μM (in DMSO) behandelt. Als Kontrolle wurden die Zellen nur mit Vehikel behandelt.

Alle Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von 80 % gezüchtet. Anschließend wurde das Medium gegen Medium ohne FBS (Eierstockkrebs-Karzinom-Zelllinien) oder Ultroser G-Serumersatz (Pall Life Sciences) (FT-Zelllinien) ausgetauscht und die Zellen weitere 72 Stunden lang kultiviert. Das konditionierte Medium wurde dann durch Zentrifugation gereinigt und unter Verwendung eines Millipore Amicon Ultra-15-Zentrifugalfilters (Millipore Sigma) konzentriert. Der Proteingehalt des konditionierten Mediums wurde unter Verwendung des Pierce BCA-Kit-Protokolls (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert und die Western Bot-Methode wurde wie unten beschrieben durchgeführt.

Ganzzelllysate wurden unter Verwendung von M-PER-Puffer (Thermo Fisher Scientific) hergestellt. Der Proteingehalt des gesamten Zelllysats wurde unter Verwendung des Pierce BCA-Kit-Protokolls (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert. Proteine (20–30 µg) wurden auf einer SDS-PAGE mit 4–20 % Gradienten aufgetrennt, bevor sie mit dem Turbo-Blot-System (Bio-Rad) auf eine PVDF-Membran übertragen wurden. Die Membranen wurden über Nacht bei 4 ° C mit Primärantikörpern inkubiert (siehe Ergänzungstabelle 3). Nach dem Waschen wurden die Membranen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern inkubiert. Proteine wurden mit dem Clarity Chemiluminescent HRP Antibody Detection Reagent (Bio-Rad) nachgewiesen und mit einem Chemi-Doc-Bildgebungssystem (Bio-Rad) sichtbar gemacht. Die nicht zugeschnittenen Blots für alle Abbildungen finden Sie in den ergänzenden Abbildungen. 1–4.

Die LINE-1-Methylierung wurde mit dem Global DNA Methylation – LINE-1 Kit (Active Motif, Kat.-Nr. 55017) gemäß den Empfehlungen des Herstellers bewertet. Das LINE-1 Kit ist ein ELISA-basierter Assay zum Nachweis und zur Quantifizierung von 5-Methylcytosin-Spiegeln in menschlicher genomischer DNA. Kurz gesagt, FT-Zelllinien wurden wie zuvor beschrieben mit Decitabin oder DMSO behandelt. Anschließend wurde genomische DNA (gDNA) mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Kat.-Nr. 69504) extrahiert. Ein μg gDNA jeder Probe wurde über Nacht mit MseI-Enzym (10 U/μL) bei 37 °C verdaut. 100 ng verdaute gDNA wurden mit der LINE-1-Sonde in einem Thermocycler hybridisiert (98 °C für 10 Minuten, 68 °C für 1 Stunde, gefolgt von einem schnellen Anstieg auf 25 °C). Die LINE-1-Sonde ist ein 5'-biotinyliertes Oligo, das für die Hybridisierung mit einer 290-bp-Region des LINE-1-Wiederholungselements entwickelt wurde. Diese Region enthält 88 Cytosinreste, von denen 12 in einem CpG-Kontext stehen. Die Reaktionen wurden technisch in dreifacher Ausfertigung vorbereitet. PCR-Proben wurden auf eine mit Streptavidin beschichtete Platte übertragen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubiert. Dann wurde eine 1:100-Verdünnung des monoklonalen 5-Methylcytosin-Antikörpers 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer 1-stündigen Inkubation des HRP-konjugierten Sekundärantikörpers. Entwicklungslösung wurde zugegeben und 3 Minuten lang inkubiert, bis die Stopplösung zugegeben wurde. Abschließend wurde die Platte bei 450 nm ausgelesen. Parallel zu den mit Decitabin behandelten Proben wurden methylierte und nicht methylierte DNA-Standardproben hergestellt.

Konditionierte Medien von Eierstockkrebs oder Kontroll-Eileiterepithelzellen wurden mit Schweine-Trypsin gemäß unserem zuvor beschriebenen Harnstoffprotokoll33 verdaut. Kurz gesagt, 36 mg Harnstoff (Sigma-Aldrich) wurden zu 100 μl konditioniertem Medium bis zu einer Endkonzentration von 6 M hinzugefügt. Der pH-Wert der Lösung wurde bei Bedarf mit 1 M Tris pH 8,0 auf 8,0 eingestellt. Die Proteine wurden mit 6 μl 0,5 M Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) (Bio-Rad) reduziert und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Proben wurden auf Raumtemperatur abgekühlt und durch Zugabe von 12 μl 0,5 M Iodacetamid (IAA) (Sigma-Aldrich), frisch aus Pulver hergestellt, vor der Inkubation ohne direktes Licht für 30 Minuten bei Raumtemperatur alkyliert. Die Harnstoffkonzentration wurde mit 400 μl 0,2 M Tris-HCl, pH 8,1, auf weniger als 2 M verdünnt, 2 μg Trypsin (Promega) wurden zugegeben (durchschnittlich 1:50 E:S) und die Proben wurden 16 Minuten lang auf einem Thermomixer (Eppendorf) inkubiert h bei 37 °C und 800 U/min. Nach 16 Stunden wurden 2 μg frisches Trypsin zugegeben und 2 Stunden bei 37 °C und 800 U/min inkubiert. Nach 2 Stunden wurden 20 μl reine Ameisensäure zugegeben, um die Reaktion abzuschrecken (endgültiger pH-Wert < 2,5). Aufgeschlossene Proben wurden separat mit 10 mg Oasis® HLB-Extraktionskartuschen entsalzt, die an einem Vakuumverteiler (Waters) montiert waren. Vor dem Laden der Probe wurden die Kartuschen mit 1 ml 90 % Acetonitril/0,1 % Ameisensäure benetzt und mit 1 ml 0,1 % Ameisensäure äquilibriert. Nachdem jede Probe geladen wurde, wurden die Kartuschen mit 3 ml 0,1 %iger Ameisensäure gewaschen und die Peptide wurden in ein frisches 1,5 ml-Polyröhrchen unter Verwendung von zwei Zugaben von 0,3 ml 40 %igem Acetonitril/0,1 % Ameisensäure eluiert. Die Proben wurden durch Vakuumzentrifugation getrocknet und bis zur Verwendung trocken bei –80 °C gelagert.

Von Patienten mit Eierstockkrebs gesammelte Aszitesflüssigkeit wurde mit Lys'C und Schweinetrypsin gemäß unserem zuvor beschriebenen Harnstoffprotokoll34 verdaut. Kurz gesagt, 60 μl 9 M Harnstoff (Sigma-Aldrich) wurden zu 30 μl Aszitesflüssigkeit (durchschnittliche Proteinkonzentration 33,7 mg/ml nach BCA) bis zu einer Endkonzentration von 6 M gegeben. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 8,0 eingestellt notwendig mit 1 M Tris pH 8,0. Die Proteine wurden mit 6 μl 0,5 M Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) (Bio-Rad) reduziert und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Proben wurden auf Raumtemperatur abgekühlt und durch Zugabe von 12 μl 0,5 M Iodacetamid (IAA) (Sigma-Aldrich), frisch aus Pulver hergestellt, vor der Inkubation ohne direktes Licht für 30 Minuten bei Raumtemperatur alkyliert. Die Harnstoffkonzentration wurde mit 300 μl 0,2 M Tris-HCl, pH 8,1, auf 1,5 M verdünnt. Lysyl-Endopeptidase (lys-C) (Wako) wurde in 50 mM Essigsäure auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml gelöst und jeder Probe wurden 40 μl zugesetzt (durchschnittlich 1:50 E:S). Die Proben wurden auf einem Thermomixer (Eppendorf) 2 Stunden lang bei 37 °C und 800 U/min inkubiert. Nach 2 Stunden wurden 10 μg Trypsin (Promega) zugegeben (durchschnittlich 1:100 E:S) und die Proben wurden 16 Stunden lang bei 37 °C und 800 U/min inkubiert. Nach 16 Stunden wurden 10 μg frisches Trypsin zugegeben und 2 Stunden bei 37 °C und 800 U/min inkubiert. Zwanzig Mikroliter reine Ameisensäure wurden hinzugefügt, um die Reaktion abzuschrecken (pH < 2,5). Schwere Peptidstandards (jeweils 75 fmol) wurden zu jeder Verdauungsvertiefung gegeben und die Proben wurden mit einer 30 mg Oasis® HLB-Extraktionsplatte (Waters), die auf einem Überdruckverteiler (Waters) montiert war, entsalzt. Die Vertiefungen wurden mit 1,5 ml 80 % Acetonitril/0,1 % Ameisensäure gewaschen und mit 2 ml 0,1 % Ameisensäure unter Anwendung von 15 psi äquilibriert. Vor dem Übertragen der Proben mit einer Mehrkanalpipette wurden weitere 0,2 ml 0,1 %ige Ameisensäure in die Nasskartusche gegeben. Nachdem die Proben geladen wurden, wurden die Kartuschen durch Überdruck (9 psi) mit 3 ml 0,1 %iger Ameisensäure gewaschen. Nach dem Waschen wurden die verdauten Plasmapeptide mit zwei Volumina von 0,5 ml 50 % Acetonitril/0,1 % Ameisensäure (6 psi) eluiert. Die Elutionsplatte wurde mit BioExcell®-Folie (World Wide Medical Products) abgedeckt, eingefroren und durch Vakuumzentrifugation getrocknet, dann mit Aluminiumfolie versiegelt und bis zur Verwendung bei –80 ° C gelagert.

Vierzig Mikroliter Plasma pro Patientin mit Eierstockkrebs wurden manuell in dreifacher Ausfertigung in 96 Deep-Well-Platten abgegeben und mit Lys-C und Trypsin unter Verwendung unseres Harnstoffprotokolls verdaut, das wie zuvor beschrieben für die Automatisierung angepasst wurde34. Kurz gesagt, 100 μl 9 M Harnstoff und 25 μl 0,25 M TCEP wurden in die Quadranten 1 und 2 einer 384-Well-Platte (Greiner) für jedes entsprechende Well einer 96-Well-Platte mit Probe gegeben (ergänzende Abbildung 5A) und hineingegeben Position 7 auf einem Bravo LT-Roboter (Agilent) (ergänzende Abbildung 6). Probenplatte, Reagenzienplatten, Pipettenspitzen und Lösungsmittelplatten wurden auf Bravo LT geladen, wie in der ergänzenden Abbildung 6 gezeigt. Bravo LT wurde mit einer speziellen schwarzen Abdeckung abgedeckt, um das Eindringen von Licht zu minimieren, und das Bravo-Aufschlussprogramm wurde gestartet. Achtzig Mikroliter 9 M Harnstoff und 15 μl 0,25 M Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) (Bio-Rad) wurden zu jeder Probe gegeben und die Probenplatte wurde auf den temperaturgesteuerten Schüttler in Position 4 bewegt (ergänzende Abbildung 6). ) und 30 Minuten bei 37 °C und 800 U/min inkubiert. Iodacetamid (IAA) (Sigma-Aldrich) wurde in 0,2 M Tris-HCl, pH 8,1, auf eine Endkonzentration von 0,5 M gelöst und 50 μl in Quadrant 3 der 384-Well-Platte in Position 7 auf dem Bravo-Deck gegeben (ergänzende Abb. 6). Nach 30-minütiger Denaturierung des TCEP-Proteins bewegte der Bravo-Roboter die Probenplatte zurück auf Position 5 und fügte jeder Probe 20 μl 0,5 M IAA hinzu, bevor er 30 Minuten lang ohne Mischen im Dunkeln inkubierte. Lysyl-Endopeptidase (lys-C) (Wako) wurde in 50 mM Essigsäure auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml gelöst und 100 μl wurden zu Quadrant 1 der 384-Well-Platte 2 gegeben (ergänzende Abbildung 5B). Einhundert Mikroliter Schweine-Trypsin (Promega), formuliert in 50 mM Essigsäure mit 0,5 mg/ml, wurden zu Quadrant 2 von Platte 2 gegeben (ergänzende Abbildung 5B) und in Position 6 auf Bravo LT platziert (ergänzende Abbildung 6). Nach 30-minütiger IAA-Proteinalkylierung wurden 300 μl 0,2 M Tris-HCl, pH 8,1, und 100 μl Lys-C (E:S 1:50) hinzugefügt. Die Probenplatte wurde manuell in einen Offline-Thermomixer (VWR) überführt und 2 Stunden lang bei 37 °C und 800 U/min inkubiert. Nach der Lys-C-Verdauung wurde die Probenplatte wieder in Position 5 auf dem Bravo-Deck gestellt (ergänzende Abbildung 6) und 48 μl Trypsin wurden in jede Probenvertiefung abgesaugt (E:S 1:100). Die Probenplatte wurde manuell in einen Offline-Thermomixer (VWR) überführt und 2 Stunden lang bei 37 °C und 800 U/min inkubiert. Nach 2 Stunden wurde eine zweite Trypsin-Zugabe von 48 μL in die Proben aufgenommen. Anschließend wurde die Bravo-Methode angehalten, die Platte mit einer Plastikdichtung abgedeckt und 16 Stunden lang bei 37 °C und 800 U/min auf einem Offline-Thermomixer inkubiert. Nach 16 Stunden wurden 90 μl 10 %ige Ameisensäure in jede Probe gegeben, um die enzymatische Aktivität zu unterdrücken (1 % Endkonzentration). Schwere Peptidstandards (jeweils 150 fmol) wurden zu jeder Verdauungsvertiefung gegeben und unter Verwendung einer 30 mg Oasis® HLB-Extraktionsplatte (Waters), die auf einem Überdruckverteiler (Waters) montiert war, entsalzt. Die Vertiefungen wurden mit 1,5 ml 80 % Acetonitril/0,1 % Ameisensäure gewaschen und mit 2 ml 0,1 % Ameisensäure unter Anwendung von 15 psi äquilibriert. Vor dem Übertragen der Proben mit einer Mehrkanalpipette wurden weitere 0,2 ml 0,1 %ige Ameisensäure in die Nasskartusche gegeben. Nachdem die Proben geladen wurden, wurden die Kartuschen durch Überdruck (9 psi) mit 3 ml 0,1 %iger Ameisensäure gewaschen. Nach dem Waschen wurden die verdauten Plasmapeptide mit zwei Volumina von 0,5 ml 50 % Acetonitril/0,1 % Ameisensäure (6 psi) eluiert. Die Elutionsplatte wurde mit BioExcell®-Folie (World Wide Medical Products) abgedeckt, eingefroren und durch Vakuumzentrifugation getrocknet, dann mit Aluminiumfolie versiegelt und bis zur Verwendung bei –80 ° C gelagert.

Vier für das LINE-1-ORF1p/L1RE1-Genprodukt einzigartige Peptide (LORF1, Uniprot Q9UN81, LORF1_HUMAN) wurden als Immunogene für die Antikörpererzeugung ausgewählt: LTADLSAETLQAR, LSFISEGEIK, LIGVPESDVENGTK und NEQSLQEIWDYVK. Polyklonale Kaninchenantikörper wurden in weißen Neuseeland-Kaninchen nach einem standardmäßigen 77-Tage-Protokoll (New England Peptide) erzeugt, wie zuvor beschrieben mit Modifikationen35. Kurz gesagt: Peptide wurden mit einer Reinheit von 85 % mit einem zusätzlichen Cystein am N-Terminus synthetisiert und zur Immunisierung an KLH konjugiert. Die Peptide wurden kombiniert und zwei Kaninchen wurden in absteigenden Dosen über 70 Tage immunisiert. Die Antiserentiter der letzten Blutproben wurden mittels Peptid-ELISA gemessen. Zwei Peptide mit dem höchsten Titer, LSFISEGEIK und LIGVPESDVENGTK, wurden seriell aus einem Pool endgültiger Blutproben durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Sulfolink-Säule (Thermo Fisher Scientific) gereinigt, an die das immunisierende Peptid gebunden war. Kurz gesagt, die Seren wurden an die Säule gebunden, die das Peptid mit dem niedrigsten Titer enthielt; Anschließend wurde der Durchfluss, von dem erwartet wurde, dass er Antikörper enthielt, die für nachfolgende Peptide mit höherem Titer spezifisch sind, an die Säule gebunden, die das Peptid mit dem nächsthöheren Titer enthielt, um die Ausbeute für jeden Antikörper zu maximieren. Nachdem das Antiserum gebunden war, wurde ein ausgedehnter Waschvorgang (> 100 CV) durchgeführt, um das latente Passagierpeptid vor der Elution mit Glycinpuffer, pH 2,5, zu reduzieren. Gereinigte Antikörper wurden in 25 % Glycerin/1X PBS/0,1 % NaN3 dialysiert und bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert.

Zwanzig Mikrogramm jedes Antikörpers wurden mit Protein-G-Magnetkügelchen (Thermo Fisher Scientific) bei 4 °C über Nacht inkubiert, wobei ein Verhältnis von Kügelchenvolumen zu μg Antikörper von 2:1 verwendet wurde. Nach dem Waschen der Perlen mit 1X PBS/0,03 % CHAPS wurde die Hälfte der Antikörperkügelchen mit 20 mM DMP wie zuvor beschrieben vernetzt37. Die Antikörpereinfangeffizienz und die Bestimmung des Passagierpeptids wurden durch Zugabe schwerer Peptide zu verdautem Kontrollplasma oder -puffer und Anreicherung mit Antikörpern mit und ohne Vernetzung durchgeführt (siehe Abschnitt „Automatisierte Peptid-Immunaffinitätsanreicherung auf KingFisher“). Extrahierte Ionenchromatogramme schwerer Peptide wurden verwendet, um die Einfangeffizienz zu vergleichen, während die relative Häufigkeit des Signals leichter Peptide verwendet wurde, um den Prozentsatz des Passagierpeptids im Antikörper abzuschätzen. Entsprechende „schwere“ Peptide, die am C-Terminus ein stabiles isotopenmarkiertes Lysin enthalten, wurden synthetisiert, auf mehr als 95 % gereinigt, in 30 % Acetonitril/0,1 % Ameisensäure formuliert und durch Aminosäureanalyse (New England Peptide) quantifiziert. Schwere Peptide wurden mittels LC-MRM-MS als Mischung für „leichte“ (endogene) und „schwere“ (Standard-)Versionen des Peptids analysiert, um die relative Menge an unmarkiertem Peptid im schweren Peptidstandard zu bestimmen (siehe „NanoLC-MRM“) Abschnitt „MS-Analyse“).

Getrocknete verdaute Proben aus 100 μl konditioniertem Medium, 30 μl Aszitesflüssigkeit oder 20 μl Plasma wurden in 200 μl 1 × PBS/150 mM Tris pH 8,0/0,03 % CHAPS resuspendiert und kurz bei Raumtemperatur vortexen, bevor sie in einen 250 μl-Puffer überführt wurden KingFisher-Wellplatte (außer Plasmaproben, die direkt in der Wellplatte getrocknet wurden). Peptide wurden mithilfe von Magnetkügelchen auf dem KingFisherTM-Magnetkügelchen-Handler durch Immunaffinitätsanreicherung (IAE) wie zuvor beschrieben extrahiert33. Kurz gesagt, eine Mischung von Antikörpern, die eine optimierte Menge an Ab pro IAE (z. B. 0,5 μg, 1 μg oder 2 μg) enthielt, wurde durch Trommelmischen (Labquake® (Thermo Fisher)) an 1 μm große Protein-G-Magnetkügelchen (Thermo Fisher Scientific) gebunden Wissenschaftlich)) mit 2 μL Perlen/1 μg Antikörper über Nacht bei 4 °C. Antikörperkügelchen wurden zweimal mit 1 × PBS/0,03 % CHAPS gewaschen, in einem äquivalenten Volumen 1 × PBS/0,03 % CHAPS resuspendiert und in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde mit einem Aluminiumfolienkleber versiegelt und über Nacht bei 4 °C vorsichtig im Trommelrührer gemischt. Nach der Inkubation wurde die Platte auf einen KingFisherTM-Magnetbead-Prozessor (Thermo Fisher Scientific) übertragen, der mit einem PCR-Magnetkopf ausgestattet war. Die Perlen wurden zweimal 1,5 Minuten lang mit 250 μl 1 × PBS/0,03 % CHAPS und einmal 1,5 Minuten lang mit 0,1 × PBS/0,03 % CHAPS gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Perlen in eine 100 μl PCR-Platte mit 50 μl 3 % Acetonitril/5 % Essigsäure überführt, um das gebundene Material zu eluieren. Nach der Elution wurden die Perlen in einer Platte gesammelt, die 200 μl 1X PBS/0,03 % CHAPS/0,1 % Natriumazid enthielt.

Mit Antikörpern angereicherte Proben wurden mit AssayMAP Bravo Reverse Phase S (RPS)-Kartuschen entsalzt34. Antikörperkügelchen-Eluate in einer 96-Well-PCR-Platte von Bio-Rad wurden auf Bravo in Position 6 platziert. AssayMAP RPS-Kartuschen und Lösungsmittel wurden auf Bravo platziert, wie in der ergänzenden Abbildung 6 dargestellt. RPS-Kartuschen wurden mit 50 µL 90 % Acetonitril/0,01 % vorbereitet. Ameisensäure bei 300 μL/min und äquilibriert mit 50 μL 0,1 %iger Ameisensäure bei 25 μL/min. Anschließend wurden die Proben mit 2 μl/min auf Kartuschen geladen. Die Kartuschen wurden zweimal mit 50 μl 0,1 % Ameisensäure gewaschen und mit 50 μl 40 % Acetonitril/0,01 % Ameisensäure bei 5 μl/min eluiert. Die Eluate wurden getrocknet und vor der LC-MRM-MS-Analyse in 3 % Acetonitril/5 % Essigsäure resuspendiert.

Mit Antikörpern angereicherte entsalzte Proben aus konditionierten Medien, Aszites und Plasma wurden auf einem TSQ Quantiva Triple-Quadrupol-Massenspektrometer analysiert, das mit einer Nanospray Flex-Quelle (Thermo Fisher Scientific) und einem Easy-nLC 1000-System ausgestattet war. Die Ionenquelle wurde auf den positiven Ionenmodus mit einer Kapillartemperatur von 300 °C, einer Sprühspannung von 2000 und einem Spülgas auf 0 eingestellt. Das Easy-nLC 1000-System wurde mit mobiler Phase A (3 % Acetonitril/0,1 % Ameisensäure) und mobiler Phase B vorbereitet (90 % Acetonitril/0,1 % Ameisensäure). Proben wurden injiziert (4 μl, 40 % der angereicherten Probe) auf eine PicoFrit-Säule (New Objective) mit 0,075 mm Innendurchmesser, gezogen auf einen 10 μm-Emitter und speziell auf 20 cm gepackt mit 1,9 μm 200 Å C18-AQ Reprosil-Kügelchen (Dr. Maisch). Der LC-Gradient betrug 5 % B für 3 Minuten, 5 % B bis 40 % B in 50 Minuten, 40 % B bis 90 % B in 2,3 Minuten. Pro Peptid wurden drei Übergänge durch geplantes MRM unter Verwendung eines 8-minütigen RT-Fensters und einer Zykluszeit von 1,5 s überwacht. Die Kollisionsenergien wurden über 4 Schritte optimiert, 2,5 V pro Schritt in kleineren außerplanmäßigen Chargen von weniger als 500 Übergängen pro Charge.

Extrahierte Ionenchromatogramme (XIC) aller Übergangionen wurden mithilfe eines Skyline-Dokuments (Skyline-Version 4.1.0.11796 https://brendanx-uw1.gs.washington.edu/labkey/project/home/software/Skyline/begin.view44) integriert. Die relative Peptidhäufigkeit wurde als Verhältnis der leichten zur schweren Peakfläche angegeben.

Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc.) durchgeführt. Unterschiede in der ORF1p-Immunreaktivität oder den zusammengesetzten Werten zwischen morphologisch normalem FTE, STIC und invasivem HGSOC wurden mithilfe des Kruskal-Wallis-Tests und anschließend des Dunn-Tests für mehrere Gruppenvergleiche untersucht. Die statistische Analyse der iMRM-Quantifizierungsergebnisse wurde mit MSstats v3.7.3 auf Peptidebene anhand der log2-Intensitäten der endogenen Peptide für jeden Übergang nach Normalisierung auf das entsprechende mit stabilen Isotopen markierte Standardpeptid durchgeführt. Die Daten wurden aus Skyline exportiert und individuell formatiert, damit MSstats die iMRM-Daten für jedes Protein getrennt nach Peptid analysieren konnte. Peakflächen aller Proben wurden einbezogen, unabhängig davon, ob durch manuelle Inspektion der XICs endogene Peptidmengen nachgewiesen wurden.

Die Studie wurde im Einklang mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Diese Studie wurde vom Institutional Review Board des Brigham and Women's Hospital (BWH), des Massachusetts General Hospital (MGH), Boston, MA, und der University of Pennsylvania (UPenn) genehmigt. Alle Protokolle zur Blutentnahme wurden vom Massachusetts General Hospital Institutional Review Board genehmigt und alle Probanden gaben eine schriftliche Einverständniserklärung.

Eine eingeschränkte Expression von LINE-1 ORF1p auf tumorerzeugendes Gewebe wurde bei einer Vielzahl von Krebsarten, einschließlich Eierstockkrebs, nachgewiesen. Da krebsspezifische Proteine als potenzielle Biomarker dienen können, haben wir die ORF1p-Expression im Zusammenhang mit zwei von der FDA zugelassenen Biomarkern für Eierstockkrebs, HE4 und CA-125, bewertet. Wie erwartet exprimierten nur Krebszelllinien ORF1p, HE4 und CA-125. Insbesondere beobachteten wir, dass jeder Marker ein einzigartiges Expressionsmuster in den verschiedenen Zelllinien-Lysaten aufwies (Abb. 1A). Obwohl ORF1p beispielsweise in COV318-Zellen exprimiert wurde, exprimierten diese Zellen weder HE4 noch CA-125. In ähnlicher Weise exprimierten OVSAHO-Zellen ausschließlich HE4, vernachlässigten jedoch ORF1p oder CA-125 (Abb. 1A). Da die ORF1p-Expression in einem breiten Spektrum von Eierstockkrebsproben beobachtet wird und unabhängig von HE4 und CA-125 ist, postulieren wir, dass ORF1p als nützlicher Analyt in einem multimodalen Multi-Biomarker-Screening-Tool für Eierstockkrebs dienen könnte.

LINE1 ORF1p ist in konditionierten Medien von HGSOC nachweisbar und ergänzt andere bekannte Biomarker. (A) Ganze Zelllysate. ORF1p-, HE4- und CA125-Proteinexpression (WB) in FT- und HGSOC-Zelllinien. Analysierte Marker zeigen eine unterschiedliche Expression zwischen FT- und HGSOC-Zellen. Vinculin wurde als interne Kontrolle verwendet. (B) ORF1p-Proteinexpression (WB) in konditionierten serumfreien Medien von FT und HGSOC. (C) Ganzes Zelllysat. ORF1p-Proteinexpression (WB) in sechs primären HGSOC-Zellen, die aus Aszitesflüssigkeit (DF-Zellen) stammen. Vinculin wurde als interne Kontrolle verwendet. (D) ORF1p-Proteinexpression (WB) in primären HGSOC-Zellen in konditionierten serumfreien Medien.

Um das Potenzial von ORF1p als Biomarker weiter zu testen, haben wir untersucht, ob Eierstockkrebszellen ORF1p in die Medien freisetzen können. Zu diesem Zweck analysierten wir die konditionierten Medien von Zellen in Kultur. Wie vorherzusehen war, gab keine der FT-Zelllinien ORF1p frei. Im Gegensatz dazu setzen Eierstockkrebs-Zelllinien leicht nachweisbares ORF1p frei, mit Ausnahme von Kuramochi und OVSAHO (Abb. 1B), die ebenfalls eine geringere Expression von ORF1p in Ganzzelllysaten zeigten (Abb. 1A). Um zu beurteilen, ob die in HGSOC-Zelllinien beobachtete ORF1p-Expression und -Freisetzung Artefakte der Zellkultur waren, untersuchten wir ORF1p auch in primären Tumorzellen, die aus Aszitesflüssigkeit von Patienten mit fortgeschrittenem HGSOC (DF-Zelllinien) stammen45. Tatsächlich beobachteten wir, dass alle sechs primären DF-Zelllinien eine nachweisbare ORF1p-Expression aufwiesen (Abb. 1C) und ORF1p in konditionierte Medien freisetzten (Abb. 1D). Insgesamt ist die Expression von ORF1p auf Krebszellen beschränkt, und seine Freisetzung in Zellmedien macht ORF1p zu einem guten Kandidaten für die Untersuchung seines Potenzials als Biomarker.

Die Freisetzung von ORF1p durch HGSOC-Zellen veranlasste uns zu der Frage, ob ORF1p in biologischen Flüssigkeiten von Patienten mit dieser Krankheit nachgewiesen werden könnte. Um dieser Möglichkeit zu begegnen, haben wir die Überwachung mehrerer Immunreaktionen und anschließende Massenspektrometrietests (iMRM-MS) entwickelt, um zwei Peptide nachzuweisen, die ORF1p eindeutig identifizieren (siehe Abschnitt „Methoden“).

Um die Leistung des Assays zu beurteilen, haben wir zunächst Antwortkurven in einem Standard-Plasmahintergrund erstellt und dabei das in der Probe vorhandene endogene Peptidsignal als Referenz verwendet. Stark markierte synthetische Peptide aus LINE-1 ORF1p wurden in dreifacher Ausfertigung in Konzentrationen von 5 amol/μL bis 50 pmol/μL in 10 μl verdautes Plasma gegeben. Unter Verwendung des Quasar-Programms in Skyline für die Antwortkurvenanalyse und unter der Annahme einer endogenen Konzentration von 1 fmol/μL in der Probe betrug die Nachweisgrenze 80 amol/μL für das Peptid LIGVPESDVENGTK und 280 amol/μL für das Peptid LSFISEGEIK im Plasma (ergänzende Abb . 7A und B).

Um anschließend zu beurteilen, ob iMRM-MS eine ähnliche Anzeige der relativen ORF1p-Häufigkeit liefert wie Western-Blot-Analysen und zur Messung in komplexen biologischen Flüssigkeiten eingesetzt werden könnte, haben wir die ORF1p-Expression durch iMRM-MS in Begleitsätzen konditionierter Medien aus Zellen untersucht Linien und primäre Patientenkulturen. In konditionierten Medien waren die iMRM-MS-Ergebnisse denen, die wir in Western Blots fanden, sehr ähnlich, wobei die ORF1p-Konzentrationen in COV318-Zellüberständen am höchsten waren und in Überständen gesunder FT-Zellkulturen nicht nachweisbar waren (Abb. 2A). Konditionierte Medien aus primären menschlichen DF-Zelllinien wurden nicht durch iMRM-MS analysiert; Allerdings wurden die ORF1p-Spiegel in den Aszitesflüssigkeitsproben des Patienten, aus denen diese Zelllinien abgeleitet wurden, in allen sechs Fällen gemessen und nachgewiesen (Abb. 2B). Angesichts der erwarteten erheblichen Unterschiede in der intraperitonealen Tumorlast und dem gesamten Aszitesvolumen zwischen Patienten gab es einen überraschenden Grad an Übereinstimmung in den relativen Intensitäten des ORF1p-Signals zwischen Überständen aus primären HGSOC-Kulturen und gepaarten Aszitesproben, gemessen durch Western Blot bzw. iMRM-MS (Abb. 1D, 2B). Die Signale für DF106 unterschieden sich jedoch deutlich. ORF1p war in DF106 um eine Größenordnung höher als in anderen Aszitesproben, gemessen mit iMRM-MS (Abb. 2B), während sein Wert bei der Messung im Primärbereich am unteren Ende der Verteilung lag Zelllinienüberstände mittels Western Blot (Abb. 1D). Dennoch deuten die Daten darauf hin, dass ORF1p-Spiegel durch iMRM-MS in biologischen Flüssigkeiten nachweisbar sind, obwohl die DF106-Ergebnisse betonen, dass zusätzliche Faktoren die gemessene Häufigkeit von ORF1p in komplexen biologischen Matrizen beeinflussen können.

LINE-1 ORF1p wird durch iMRM-MS in konditionierten Medien, Aszites und Plasma von HGSOC-Patienten nachgewiesen. (A) Überstände von FT- und HGSOC-Zelllinien und (B) primäre HGSOC-Zellen aus dem Aszites von Patienten wurden mittels iMRM-MS analysiert. Das Peakflächenverhältnis (PAR) von leichtem zu schwerem Peptid für den einzelnen besten Übergang wurde auf die Proteinmenge in jeder Probe normalisiert. PAR für jede Probe wurde auf die Probe mit dem höchsten Wert normalisiert und als Prozentsatz für jedes Peptid angegeben. (C) Peakflächenverhältnis von leichtem zu schwerem Peptid, das die relative Erkennung und den Unterschied zwischen gesunden und erkrankten Proben einer unabhängigen Kohorte mit 72 Fällen von HGSOC und 37 gesunden Kontrollpersonen (N = 109 Patientenplasmaproben insgesamt) zeigt.

Darüber hinaus verwendeten wir iMRM-MS, um ORF1p über verschiedene Probentypen hinweg zu bewerten, einschließlich der Signalquelle (STIC- oder HGSOC-Zellen), der Aszitesflüssigkeit und der peripheren Zirkulation, indem wir begleitende Probensätze aus zelllinienkonditionierten Medien (die als Proxy dienten) bewerteten für die peritumorale Konzentration) und Aszitesflüssigkeit oder -plasma von Patienten mit überwiegend fortgeschrittenen HGSOC-Stadien (Ergänzungsabbildung 7C – E) (Methoden und Ergänzungstabelle 3). Wie erwartet korrelierte die Menge des ORF1p-Peptid-MS-Signals umgekehrt mit der Konzentration der Hintergrundmatrix. Mittels Antikörperanreicherung von Peptiden und anschließender gezielter MS wurde mindestens eines der ORF1p-Peptide, LSFISEGEIK, in etwa 10 % der Plasmaproben sicher identifiziert, wenn auch mit einer 30-mal geringeren Signalintensität als in konditionierten Zellmedien (2.500 vs. 75.000 cps) ( Ergänzende Abb. 7E vs. 7C). Während die Verdünnung des Signals von der Quelle zum Kreislauf wahrscheinlich ein zentraler Faktor war, blieb die Konzentration der ORF1p-Peptide auch nach der Antikörperanreicherung niedrig, möglicherweise aufgrund der Signalunterdrückung durch unspezifische oder niedrigaffin bindende Peptide mit viel höherer endogener Häufigkeit.

Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt, um festzustellen, ob das erkannte Signal (2500 cps) von endogenem Protein im Plasma stammt oder ein technisches Artefakt darstellt, das entweder auf eine unvollständige Isotopenmarkierung des schweren Peptids38 oder auf ein Passagierpeptid im Antikörper (Peptide, die währenddessen an den polyklonalen Antikörper gebunden sind) zurückzuführen ist die Antikörpererzeugung und der Affinitätsreinigungsprozess; siehe Abschnitt „Methoden“)35. Wie in der ergänzenden Abbildung 8A gezeigt, war die Intensität des in einer Probe schweren Peptids beobachteten Lichtsignals sehr gering, weniger als 300 cps, und bei jedem nachweisbaren Signal stimmte das Verhältnis der Übergänge nicht mit dem des schweren Standards überein. Die Signalintensität des leichten Peptids blieb bei der Antikörperanreicherung im Puffer- und Kontrollplasma niedrig und unverändert und wies in allen Fällen ein Übergangsverhältnis auf, das nicht mit dem des schweren Peptids übereinstimmte. Daher gab es keine Hinweise auf ein Artefakt aufgrund exogener Peptide. Obwohl im Patientenplasma das Verhältnis von leichter zu schwerer Peakfläche von ORF1p unter dem lag, was allgemein als quantifizierbares Verhältnis angesehen wird (0,007), war es deutlich größer als das Signal in den Kontrolltestproben (ergänzende Abbildung 8B).

Schließlich führten wir iMRM-MS-Assays an einer Kohorte von 109 Patientenproben, bestehend aus 72 Krebspatienten und 37 gesunden Patienten, einzeln an drei verschiedenen Tagen durch, wobei wir den in MSstats bereitgestellten statistischen Rahmen verwendeten (siehe Abschnitt „Methoden“)46. Wie in Abb. 2C gezeigt, gab es in HGSOC-Proben im Vergleich zu den Kontrollen einen Trend zu höheren ORF1p-Konzentrationen, obwohl die fache Änderung (log2 = 0,035) statistisch nicht signifikant war.

Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass ORF1p sicher im Blutkreislauf von Patienten mit HGSOC nachgewiesen werden kann. Dennoch wären weitere Verbesserungen der Quantifizierungsgrenzen des Assays und eine größere Testpopulation erforderlich, um genauere quantitative Schätzungen der Leistung von ORF1p als plasmadiagnostischer Biomarker zu liefern.

Die Beobachtung, dass ORF1p von HGSOC-Zellen exprimiert wird und in biologischen Flüssigkeiten nachweisbar ist, veranlasste uns zu untersuchen, ob die ORF1p-Expression ein frühes oder spätes Ereignis bei der HGSOC-Tumorentstehung ist. Wir verwendeten Immunhistochemie (IHC), um die ORF1p-Expression in Gewebeproben von 30 Patienten mit diagnostiziertem HGSOC und 12 gesunden Kontrollpersonen zu beurteilen. p53- und Ki-67-Färbungen wurden durchgeführt, um Karzinomzellen bzw. proliferative Zellen zu identifizieren (Abb. 3A). In den HGSOC-Fällen wurden in 18 Proben ein oder mehrere STICs identifiziert, während in 25 Fällen benachbarte, morphologisch normale FTE vorhanden waren. Normales FT-Epithel war negativ für die ORF1p-Expression, während HGSOC in fast allen Fällen diffus positiv war (Abb. 3A, Tabelle 1). Das Fehlen einer Expression im FT-Epithel wurde in Fällen mit und ohne STIC oder HGSOC beobachtet, was darauf hindeutet, dass normales gutartiges FT-Epithel ORF1p-negativ ist. Die Expression in HGSOC war im Allgemeinen robust und diffus (Abb. 3A, B) mit einer zytoplasmatischen oder panzellulären Verteilung (Abb. 3B). Interessanterweise war die Expression in STIC-Läsionen robust, als wir die IHC-Scores in negative (0 und 1) und positive (2 und 3) Gruppen unterteilten, wobei 14/18 Fälle positiv waren (Abb. 3A, Tabelle 1).

Die Expression von LINE-1 ORF1p ist ein frühes Ereignis in der Tumorentstehung von serösem Eierstockkrebs. (A) LINE-1-ORF1p-Expression (IHC) in Gewebe aus morphologisch gutartigem Eileiterepithel (FTE), serösem Tuben-Intraepithelkarzinom (STIC) und invasivem hochgradigem serösem Ovarialkarzinom (HGSOC). Reichlich vorhandener ORF1p wird in STIC-Läsionen und HGSOC exprimiert, während normales FTE negativ ist. Die p53-Färbung identifiziert die Karzinomzellen und Ki-67 die proliferativen Zellen im STIC und im invasiven Tumor. Alle mikroskopischen Aufnahmen (20-faches Objektiv) wurden von einem repräsentativen Fall aufgenommen, um die Lage der Läsionen auszurichten. (B) Zelluläre Verteilung von ORF1p in HGSOC. Es werden zwei repräsentative Fälle gezeigt, die ein zytoplasmatisches und membranöses Färbemuster aufweisen (40-faches Objektiv).

Jüngste genomische Studien zu FT-Vorläufern und HGSOC haben gezeigt, dass bei fortgeschrittenem HGSOC das Vorhandensein scheinbarer STIC im FT tatsächlich eine metastatische Erkrankung sein kann, die sich als Vorläufer ausgibt47,48,49,50. Um dieser Möglichkeit Rechnung zu tragen, haben wir sechs Fälle zufälliger STIC-Läsionen aus risikomindernden Operationen auf ORF1p-Expression gefärbt. In diesen Fällen liegt keine invasive Erkrankung vor. In vier der sechs Fälle wurde eine ORF1p-Expression nachgewiesen. Wie in den Fällen mit HGSOC war die ORF1p-Expression in den malignen STIC-Zellen robust und nicht im angrenzenden normalen FT-Epithel (Abb. 4). Diese Ergebnisse bestätigen, dass die ORF1p-Expression in FT-Vorläufern von HGSOC erfolgt.

LINE-1 ORF1p wird in zufälligen STIC-Läsionen exprimiert. Repräsentative Bilder der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E), der p53- und LINE-1-ORF1p-Expression in Läsionen des Eileiterepithels (FTE) und serösen Tuben-Intraepithelkarzinoms (STIC) (IHC). Zufällige STIC-Läsionen zeigen eine robuste zytoplasmatische und panzelluläre ORF1p-Expression (20X). Im angrenzenden gutartigen Epithel findet keine ORF1p-Expression statt. Eine intensive p53-Färbung des Kerns ist charakteristisch für die STIC-Läsion und fällt in normalem Gewebe negativ aus. Eingefügte mikroskopische Aufnahmen (40-fach) heben die normalen Flimmerzellen bei gutartigen FTE und die bösartigen Zellen bei der STIC-Läsion hervor.

Es ist gut dokumentiert, dass in normalen Körperzellen die DNA-Methylierung und verwandte Mechanismen die LINE-1-Retrotransposon-Expression hemmen. In neoplastischen Zellen ist die DNA jedoch häufig hypomethyliert, was zu einer erhöhten LINE-1-Expression führt, die bei einer Reihe von Krebsarten, einschließlich Eierstockkrebs, beobachtet wird26,51,52. Um zu beurteilen, ob die DNA-Demethylierung die Expression und Freisetzung von LINE-1 in nicht tumorigenen FT-Zellen induzieren könnte, behandelten wir vier verschiedene FT-Zelllinien 3, 5 oder 7 Tage lang mit dem DNA-Methyltransferase-Inhibitor (DNMTi) Decitabin (5 μM). Wie erwartet führte die Behandlung mit Decitabin zu einer Erschöpfung von DNMT1A (Abb. 5A) und zu einer Abnahme der LINE-1-Methylierung in FT-Zelllinien (Abb. 5B). Bezüglich ORF1p zeigten alle vier FT-Linien nach der Behandlung eine robuste ORF1p-Expression, während DMSO allein keine Wirkung hatte (Abb. 5C). Darüber hinaus haben wir ein DNMTi der zweiten Generation, SGI-110 (Guadecitabin), getestet, das rational so konzipiert wurde, dass es gegen den Abbau durch Cytidin-Desaminase resistent ist und die Exposition der Zellen gegenüber dem aktiven Metaboliten Decitabin verlängert, wodurch eine schnellere schnellere Aufnahme in die DNA gewährleistet wird sich teilende Zellen53,54. In Übereinstimmung mit unseren vorherigen Ergebnissen führte die Behandlung mit 5 μM SGI-110 bereits 3 Tage nach der Behandlung zu einer starken Expression von ORF1p (Abb. 5D). Eine längere Behandlung über 5 oder 7 Tage führte zu einer weiteren Steigerung der ORF1p-Expression, während DMSO keine Wirkung hatte (Abb. 5D). Immunfluoreszenzmikroskopie bestätigte die Expression von ORF1p in mit Decitabin behandelten im Vergleich zu unbehandelten FT-Zellen. In Übereinstimmung mit der intrazellulären Lokalisierung von ORF1p in HGSOCs wurde ORF1p überwiegend im Zytoplasma von DNMTi-behandelten FT-Zellen gefunden (Abb. 5E).

Der Verlust der DNA-Methylierung in Eileiterzellen führt zur Expression und Detektion von LINE-1 ORF1p in konditionierten Medien. FT-Zelllinien wurden 3, 5 oder 7 Tage lang mit den DNMT-Inhibitoren Decitabin oder SGI-110 (5 µM) behandelt. Als Negativkontrolle wurde DMSO verwendet. (A) DNMT1A-Proteinexpression (WB) und (B) LINE-1-Methylierungsniveaus nach Decitabin-Behandlung. Die 5-Methylcytosin-Spiegel von LINE-1 in der genomischen DNA wurden quantifiziert und die optische Dichte (OD) bei 450 nm gemessen. Es wurde ein signifikanter Rückgang der DNMT1A-Spiegel und der LINE-1-Methylierung (N = 3, ***p < 0,0002) beobachtet. (C) ORF1p-Proteinexpression (WB) in FT-Zellen nach Decitabin-Behandlung. Keine der Linien exprimierte ORF1p vor der Behandlung, aber ORF1p wurde nach 5 Behandlungstagen in allen Linien reichlich exprimiert. β-Aktin dient als Ladungskontrolle. (D) Vergleich der LINE-1-ORF1p-Expression in FT-Zellen nach Behandlung mit Decitabin oder SGI-110 durch WB. Beide Verbindungen sind gleichermaßen in der Lage, die ORF1p-Expression bereits nach 3 Tagen zu induzieren. (E) Mit Decitabin oder SGI-110 behandelte FT-Zellen wurden mittels Immunfluoreszenz auf das Vorhandensein von ORF1p untersucht (10-faches Objektiv). (F) ORF1p-Proteinexpression (WB) in konditionierten Medien von FT-Zellen nach Behandlung mit Demethylierungsmitteln. COV318 wurde als Positivkontrolle für die ORF1p-Freisetzung verwendet.

Abschließend fragten wir, ob die Behandlung von FT-Zellen mit Decitabin oder SGI-110 die Freisetzung von ORF1p fördert. Zu diesem Zweck behandelten wir FT-Zellen 5 Tage lang mit DMSO, Decitabin oder SGI-110 und analysierten ihre konditionierten Medien. In Übereinstimmung mit unseren Zellliniendaten führte die Behandlung von FT-Zellen mit DNMTis zur ORF1p-Sekretion (Abb. 5F). Zusammengenommen weisen diese Daten darauf hin, dass die DNA-Methylierung ein notwendiger Mechanismus ist, um die LINE-1-Expression und die ORF1p-Freisetzung in FT-Zellen zu hemmen.

Das menschliche Genom ist voll von repetitiven Elementen, die die Aktivität transponierbarer Elemente widerspiegeln. ZEILE-1 ist eine solche Sequenz; ein mobiles genetisches Element, das beim Menschen aktiv ist, sich selbst vermehrt und Proteine kodiert19,51,55. LINE-1-Sequenzen sind nicht nur eine wichtige Quelle vererbbarer Strukturvariationen, sondern können auch zu erworbenen Insertionen in Krebsgenomen führen19. Hier berichten wir über die Expression von ORF1p, einem der proteinkodierenden Produkte von LINE-1, bei hochgradigem serösem Eierstockkrebs. Wir verwenden unterschiedliche Ansätze, um drei Hauptbeobachtungen zu machen. Zunächst zeigen wir, dass ORF1p von Tumorzellen und primären, aus Aszites stammenden HGSOC-Zelllinien exprimiert und freigesetzt wird und dass es mithilfe von iMRM-MS sicher in biologischen Flüssigkeiten, einschließlich Aszites und Plasma von Patienten mit Eierstockkrebs, nachgewiesen werden kann. Zweitens zeigen wir, dass die Expression von ORF1p ein frühes Ereignis in der HGSOC-Entwicklung ist, da sie in FT-Vorläufern und insbesondere in zufälligen STIC-Läsionen zum Ausdruck kommt. Schließlich zeigen wir, dass die DNA-Demethylierung die ORF1p-Expression in immortalisierten FT-Epithelzellen aktivieren kann, was im Einklang mit der DNA-Methylierung steht, die als notwendiger Mechanismus zur Unterdrückung der LINE-1-Expression in diesen gutartigen Zellen fungiert.

Es wurde berichtet, dass eine Vielzahl von Krebsarten LINE-1 ORF1p exprimieren, darunter Nieren-, Speiseröhren-, Bauchspeicheldrüsen-, Lungen-, Prostata-, Brust- und Eierstockkarzinome26,27,29,56,57. Hier berichten wir, dass Eierstockkrebszellen ORF1p nicht nur exprimieren, sondern auch freisetzen, was aus Sicht der klinischen Biomarkerentwicklung von großer Relevanz ist. In diesem Zusammenhang haben wir ImmunMRM-MS-Assays entwickelt, um proteotypische ORF1p-Peptide nachzuweisen, die in der interstitiellen Gewebeflüssigkeit von HGSOC-Gewebeproben gefunden werden (Gillette et al., Manuskript in Vorbereitung). Wir haben iMRM-MS-Assays verwendet, da dieser Ansatz mehrere Hauptmerkmale aufweist: (1) die Messung von Proteinen mithilfe eines Formats, das ein hochgradiges Multiplexing von Biomarkerkandidaten mit effizienter Probenverarbeitung unterstützt; (2) Die Verwendung von Affinitätsreagenzien (Anti-Peptid-Antikörper) erhöht die relative Häufigkeit der proteotypischen Peptidziele und erhöht die analytische Empfindlichkeit ihres Nachweises in komplexen Bioflüssigkeiten, die üblicherweise in der Klinik gesammelt und gemessen werden (z. B. Plasma); und (3) die Verwendung von Massenspektrometrie anstelle eines zweiten Antikörpers sorgt für Sequenzspezifität und stellt sicher, dass die Messung vom beabsichtigten Analyten stammt34.

iMRM-MS-Assays rekapitulierten weitgehend Western-Blot-Ergebnisse in Überständen sowohl kommerzieller als auch primärer Zelllinien. Bemerkenswerterweise zeigte iMRM-MS einen abnehmenden Signalgradienten mit zunehmender Entfernung von der Signalquelle von peritumoralen Proben über Aszites zu Plasma, ähnlich wie es für die CA-125-Spiegel beschrieben wurde, die sich von Ovarialzystenflüssigkeit zu Aszites und Plasma bei Frauen mit HGSOC58 bewegen . Die allgemeine Übereinstimmung zwischen den relativen ORF1p-Spiegeln in Überständen primärer Zelllinien und den entsprechenden Aszitesproben legt nahe, dass unterschiedliche Spiegel als diagnostischer Biomarker in zugänglichen Körperflüssigkeiten dienen könnten, aber nur systematische Tests in einer großen Anzahl von HGSOC-Patientenplasmaproben und geeigneten Kontrollen können einen angemessenen Test durchführen diese Hypothese.

Während die iMRM-MS-Ergebnisse für beide konfigurierten Peptidtests stark korrelierten und beide in Überständen gut funktionierten, konnte nur der LSFISEGEIK-Test endogenes ORF1p in Patientenplasmaproben nachweisen. Als zusätzliche Proben mittels iMRM-MS aus Plasma analysiert wurden, dem die Immunaffinität der Plasmaproteine mit der höchsten Häufigkeit entzogen war (Daten nicht gezeigt), erhöhte sich die relative Anzahl der Proben, in denen ORF1p nachgewiesen wurde, um das Dreifache auf etwa 30 %. Trotz dieser Fortschritte und obwohl mit Sicherheit behauptet werden kann, dass der Nachweis im Plasma erfolgt, schließen die geringe absolute Intensität des ORF1p-Signals und die entsprechenden niedrigen Licht-Peak-Flächenverhältnisse eine genaue Quantifizierung in diesen Proben aus. Da ORF1p-Signale in Proben, in denen sie nachgewiesen werden, nur geringfügig über dem Rauschen liegen, können keine eindeutigen Aussagen über Proben gemacht werden, in denen ORF1p nicht nachgewiesen wurde. Ungeachtet dieser Einschränkungen tragen unsere Ergebnisse sicherlich dazu bei, die potenzielle Implementierung von ORF1p als Biomarker für Eierstockkrebs zu reifen und verdeutlichen die Notwendigkeit noch empfindlicherer Tests für die Untersuchung von Plasma-Biomarkern.

Die Quantifizierung von LINE-1 in biologischen Flüssigkeiten wurde in einer Reihe früherer Veröffentlichungen untersucht, wobei sein Potenzial als Krebsbiomarker hervorgehoben wurde. In Bezug auf LINE-1-DNA hat sich die Bewertung von LINE-1 durch qPCR in zirkulierender DNA in den Seren von Brustkrebspatientinnen als wertvoll für die Erkennung von Brustkrebs im Frühstadium erwiesen59. Im Hinblick auf die LINE-1-DNA-Methylierung zeigten Studien mit zellfreier DNA (cfDNA), dass Melanomserumproben signifikant höhere unmethylierte LINE-1-Werte aufwiesen als gesunde Spenderserum60. In ähnlicher Weise wurde die LINE-1-Hypomethylierung von Plasma-cfDNA als Biomarker für das Fortschreiten der Krankheit bei Darmkrebs vorgeschlagen61. Kürzlich wurden in einer Studie digitaler ELISA und Tröpfchenmikrofluidik (ddELISA) zum Nachweis von ORF1p in Serumproben von Brustkrebspatientinnen eingesetzt. Dieser Ansatz war empfindlicher als der aktuelle Goldstandard für den ultraempfindlichen Proteinnachweis62. Zusammengenommen ermutigen unsere und frühere Ergebnisse die Untersuchung und Entwicklung von LINE-1 und ORF1p als Marker bei Eierstockkrebs.

Das Stadium der neoplastischen Transformation, in dem LINE-1-Elemente aktiviert werden, ist nicht klar geklärt. Aktuelle Berichte30,31 deuten darauf hin, dass die normalen Beschränkungen der LINE-1-Expression früh in der Tumorentwicklung verloren gehen. Unsere Ergebnisse stimmen mit diesen Erkenntnissen überein, da wir beobachteten, dass ORF1p zwar im gutartigen FT-Epithel negativ ist, aber in frühen nicht-invasiven humanen HGSOC-Vorläuferläsionen (STICs) vorhanden ist und während der gesamten HGSOC-Progression erhalten bleibt. Wichtig ist, dass die Auswertung der ORF1p-Expression in zufälligen STIC-Läsionen eindeutig zeigt, dass ihre Expression eher eine Manifestation einer frühen als einer metastasierten Erkrankung ist.

Die DNA-Methylierung von LINE-1-Elementen wurde als Hauptmechanismus der Unterdrückung in normalen erwachsenen Geweben postuliert. In diesem Zusammenhang haben wir getestet, ob DNA-Demethylierungsmittel die Expression und Freisetzung von ORF1p in FT-Zelllinien induzieren können. Während der Replikation wird Decitabin in die DNA eingebaut, wo es DNMT-Enzyme kovalent einfangen kann, wodurch DNA-Protein-Addukte entstehen63 und anschließend DNMTs abgebaut werden64. Unsere Daten zeigten, dass die Behandlung von FT-Zellen mit DNMT-Inhibitoren, Decitabin und SGI-110, ausreichte, um die Expression von ORF1p und die Freisetzung in konditionierte Medien auszulösen.

Obwohl p53 als entscheidender Suppressor der LINE-1-Expression und -Aktivität in somatischen menschlichen Zellen postuliert wurde57,65, deuten unsere Daten darauf hin, dass ein p53-Mangel allein nicht zur LINE-1-Derepression und ORF1p-Expression führt. Die in dieser Studie verwendeten FT-Zelllinien wurden durch Unterbrechung des p53-Signalwegs immortalisiert41,42, FT189 und FT194 wurden mit humaner Telomerase-Reverse-Transkriptase (hTERT) und SV40-T-Antigen immortalisiert, während FT237 und FT240 ohne virale Onkoproteine und keines davon immortalisiert wurden Linien drücken ORF1p aus. Darüber hinaus haben wir und andere keine ORF1p-Expression in den frühesten Eileiterläsionen nachgewiesen, die TP53-Mutationen, bekannt als p53-Signatur, enthalten30,31, was auf die Beteiligung zusätzlicher Regulierungsmechanismen hindeutet.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ORF1p im Vergleich zu Eileiterzellen eindeutig von Eierstockkrebszellen exprimiert wird. Das Vorhandensein von ORF1p in zufälligen STIC-Läsionen weist darauf hin, dass seine Expression ein frühes Ereignis in der Tumorentstehung ist. Die scheinbare binäre Expression von ORF1p wird durch DNA-Methylierung reguliert, die während der neoplastischen Transformation verloren geht und zur Freisetzung von ORF1p in biologische Flüssigkeiten beiträgt. Obwohl empfindlichere Tests erforderlich sind, unterstützt der sichere Nachweis von ORF1p in biologischen Flüssigkeiten aus Patientenplasma seine weitere Entwicklung als potenzieller Biomarker für Eierstockkrebs.

Weitere Informationen und Anfragen zu Ressourcen und Reagenzien richten Sie bitte an den Hauptkontakt Dr. Ronny Drapkin unter [email protected]. Diese Studie generierte neue LINE-1 ORF1p-Peptid-Antikörper.

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Wir danken den Mitgliedern der Drapkin-, Burns- und Carr-Labore für fruchtbare Diskussionen, Alexandra Cocco für ihre Unterstützung bei der Bewertung der in iMRM-Assays verwendeten Antikörper- und Standardpeptidreagenzien, Sebastian Vaca für die MSstats-Analyse der iMRM-Daten und Mei Zheng für die Immunhistochemie, Dr. Adam Karpf (Universität Nebraska) für hilfreiche Diskussionen und Dr. Andrew Godwin für seine großzügige Bereitstellung von Eierstockoberflächenepithelzellen.

Diese Arbeit wurde durch ein Mentored Investigator Grant Program der Ovarian Cancer Research Alliance (891470 an PRdS), den China Scholarship Council (YF), den Skacel Family Scientific Scholar Award des Rivkin Center (SMG) und das National Cancer Institute EDRN 5U01CA152990 unterstützt (Subaward 217321 für die Jahre 1–5 und 227914 für die Jahre 6–8) (RD, MB, SC, SS, MG), NCI SPORE in ovarian cancer P50 CA228991 (RD), die Honourable Tina Brozman Foundation for Ovarian Cancer Research ( RD), der Dr. Miriam and Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (RD), der Claneil Foundation (RD), dem Run and Walk for Family and Friends with Cancer (RD), Shooting for a Cure (RD), Maggie's Memorial Fund (RD), der Helene Ross Boutz Fund for Ovarian Cancer Early Detection (RD), der Marjorie S. Stanek and Lowell H. Dubrow Ovarian Cancer Research Center Endowed Fund (RD), das Basser Center for BRCA (RD) und der Mike und Patti Hennessy Foundation (RD).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Sho Sato und Michael Gillette.

Penn Ovarian Cancer Research Center, University of Pennsylvania, Perelman School of Medicine, Philadelphia, PA, 19104, USA

Sho Sato, Pamela R. de Santiago, Yi Feng, Sara Hobday, Marilyn A. Mitchell, Kai Doberstein, Stefan M. Gysler und Ronny Drapkin

Das Broad Institute of MIT und Harvard, Cambridge, MA, 02142, USA

Michael Gillette, Eric Kuhn, Michael Burgess, Kristen Doucette, Paul J. Ippoliti und Steven A. Carr

Abteilung für Lungen- und Intensivmedizin, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, 02114, USA

Michael Gillette

Abteilung für Pathologie, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA, 02115, USA

Michelle S. Hirsch

Abteilung für Pathologie und Labormedizin, Krankenhaus der University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Lauren Schwartz

Harvard Medical School, Boston, MA, 02115, USA

Michael Gillette, Michelle S. Hirsch, Steven J. Skates, Kathleen H. Burns und Steven A. Carr

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Michael J. Birrer

Biostatistik und Computerbiologie, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA

Steven J. Skates

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Carlos Mendez-Dorantes und Kathleen H. Burns

Basser Center for BRCA, Abramson Cancer Center, University of Pennsylvania, Perelman School of Medicine, Philadelphia, PA, 19104, USA

Ronny Drapkin

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SS, MG und RD konzipierten das Projekt und den Versuchsplan. SS, EK, YF, PJI, MAM, MG, PRdS., SH, SMG, CMD, KHB und RD führten Experimente durch und analysierten die Ergebnisse. EK, MB, KD, PJI, MG und SAC entwickelten, führten und analysierten die proteomischen Experimente. MSH, LS und RD stellten Gewebe- und Pathologie-Expertise zur Verfügung. SS stellte Plasmaproben und statistische Unterstützung zur Verfügung. Alle Autoren halfen bei der Erstellung und Durchsicht des Manuskripts. RD fungierte als Gesamtstudienleiter.

Korrespondenz mit Ronny Drapkin.

R. Drapkin ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Repare Therapeutics und VOC Health. Keiner der anderen Autoren gibt an, konkurrierende Interessen zu haben.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sato, S., Gillette, M., de Santiago, PR et al. LINE-1 ORF1p als Kandidat für den Biomarker bei hochgradigem serösem Ovarialkarzinom. Sci Rep 13, 1537 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28840-5

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Eingegangen: 16. August 2022

Angenommen: 25. Januar 2023

Veröffentlicht: 27. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28840-5

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